危機環境和本土安全事件中利用快速響應GC/MS流動實驗室提高未知物識別的確認能力
引言
康涅狄格環境保護局(CT DEP)位于康涅狄格州的Windsor，是裝備GC/MS等分析儀器的流動實驗室，負責本土安全和應急環境事件的現場、快速未知化合物的測定。CT DEP應急響應隊員24/7待命，通常是救火隊員、地方或聯邦執法人員遇到不明的可能化學危險物時電話求助，他們的責任是快速識別這些物質，以便事故指揮官和執法人員作出適當的應變措施，在這種情況下，快速準確識別至關重要，因為這有助于迅速決定是對無毒物質進行簡單控制處理還是撤離周圍居民。
GC/MS是快速識別揮發和半揮發有機物的選擇工具，標準EPA方法能識別超過200種環境相關的化合物，這些方法具有很好的靈敏度，根據保留時間和GC/MS譜圖檢索可以準確識別這些目標化合物。然而，對于不能用這些方法表征的化合物，僅僅利用GC/MS譜庫檢索會產生很大的不確定性。錯誤識別對于先遣急救員和執法者，可能導致昂貴的、危險的甚至致命的錯誤響應，確認識別的不確定性或延遲也能導致公共資源的極大浪費。
為了提高未知物正確識別的可能性，需要一些分析方法進行二次確證分析，如GC/MS譜庫匹配后接下來利用質量GC/MS進行分子式確證。對于化學物識別的初期應答者，挑戰是非常嚴峻的，因為分析必須具有高度的可信度，必須快速(通常在1- 3小時內)，而且必須依靠流動實驗室中已有的分析儀器。對這些應用，對于GC/MS結果的確信和準確性需要額外的確證工具。
在質譜數據處理上的進步，對于在單位分辨質譜上實現準確的分子式識別顯示了巨大的潛力[1]。該應用基于質量數和線形校正的新技術，在單位分辨質譜上得到質量數和的同位素峰形匹配(光譜準確度)用于分子式識別，得到的結果與高分辨測量儀器具有很好的可比性。
本文呈現一個新方法，通過標準GC/MS譜庫檢索，并結合在標準單位質量分辨四極桿GC/MS儀器的分子式識別進行結果確認，提高GC/MS對未知物識別的速度和準確性。方法是基于VOC分析的標準EPA方法[2](EPA 8260B)，這里定義為EVOCA(擴展的VOC分析)。
實驗
使用標準EPA 8260B方法中7個標準替代化合物和內標，建立用于評價EVOCA的測試方案，該測試方案使用73個與環境相關的目標化合物，在另一個單獨運行中有額外17個化合物，所以共有90個化合物用于評價該方法。
73個目標化合物測試混合物溶解在10 ml水中，每種組分的濃度約為20 ug/l，通過吹掃捕集系統和50: 1的分流，每種大約4 ng的組分被引入質譜系統。17種額外化合物制成約2000 ug/ml的濃度，進樣1 ul并通過相同比例的分流，每種約40 ng的組分引入質譜系統。
Agilent 6890-5973 GC/MS系統安裝在CT DEP流動實驗室用于全部分析。分析使用標準EPA 8260B方法，除了MS被設定為Agilent的"raw“模式(原始數據模式)采集譜圖數據，原始采集模式采集和保存的MS數據是連續的，這點對于分子式識別的譜圖校正是必要的。利用Agilent Chemstation軟件對每種目標測試化合物在NIST 02譜庫中進行譜圖檢索，并列出排在前面的檢索結果。圖1顯示了73個目標化合物運行的色譜圖和一個感興趣化合物離子分析結果。額外的17種VOCs在獨立的運行中使用同樣方法進行分析，僅僅是樣品引入方式不同。
圖1. 頂圖顯示73種目標EPA化合物的總離子流圖。底圖顯示n-丁苯未校正(紅色)和校正后及理論(綠和黑色)譜圖的匹配結果，99.85%的光譜準確度匹配幾乎完全重疊
每次運行后數據被裝載進MassWorks軟件(Cerno Bioscience, Danbury, CT) ，利用表1中列出替代化合物和內標的六個選擇離子校正質譜數據，得到質量數和線形譜圖，選擇的校正離子質量涵蓋了整個感興趣的質量范圍，提供了全面的譜圖校正信息。校正然后應用在整個運行測試上，并對73種EPA目標化合物和17個額外VOCs中每種化合物譜圖進行平均。表2顯示了73種目標物中的部分化合物。根據全部分析結果的質量信息，利用每個化合物的單一同位素峰位大20 mDa質量偏差，對感興趣的離子進行分子式檢索。既然，方法代表真正未知物分析，設定未知物的元素組成為C、H、N、O、F、Br、Cl、S和P進行檢索，這些也是影響環境和健康的相關化學品中常見元素。一旦分子式列表產生，MassWorks校正線形譜圖同位素輪廓搜索(CLIPS)的分子式檢索功能被應用到選擇離子，并根據譜圖準確度列出可能分子式列表。譜圖準確度是測量校正的線形譜圖與每個候選分子式理論計算譜圖匹配程度的指標：
譜圖準確度(Spectral Accuracy) = (1- |RMSE| ) * 100
這里RMSE是校正譜圖與理論譜圖誤差的均方根，因此數據100是符合，圖2說明了匹配的例子。得到的分子式結果然后利用譜庫檢索進行確認，以驗證混合物測試的可靠性。
表1. 用于質譜校正的離子和校正誤差
圖2. CLIPS檢索后n-丁苯譜圖匹配結果。頂部顯示譜圖準確度為99.85%排名的校正譜圖(紅色)與理論譜圖(黑色)的疊加圖；底部顯示譜圖準確度為97.53%排名第二(C7H15OF)匹配圖 表2. 94種目標VOCs中的部分化合物 結果和討論 對于大部分化合物，通過NIST譜庫匹配，分子離子用于確定元素組成，但在某些情況下分子離子非常弱或沒有分子離子峰，在這種情況下，可以用一個或更多的碎片離子用于確證正確的分子式。73種目標化合物和17種額外VOCs質量準確度的標準偏差分別為13 mDa和7 mDa，保守設定大20 mDa的質量窗口用于元素組成搜索，由于設定的元素組成搜索范圍很寬，雖然通常有50-100待選化合物，但對于更高分子量的化合物可能會得到更多的待選化合物。即使在高分辨GC-TOF儀器，理想條件下的5 ppm[3]質量精度，利用這些限制元素組成搜索時也會得到約20種待選分子式，而對于“真實樣品”分析，質量準確度可能低2- 4倍。這說明通過同位素峰形進一步限制待選分子式數量對于得到更可靠的分析結果是非常重要的。 圖2說明了使用CLIPS的同位素峰形匹配。譜圖校正不但校正了線形譜圖也校正了質量軸位置，利用列表中分子式計算出的理論譜圖與測量譜圖進行準確對比，不但計算出譜圖準確度值，而且可以看到同位素輪廓比較圖，驗證其匹配程度。對于NIST或其它譜庫中不存在的真正未知物，對其進行分析也是可能的，在這種情況下，該方法至少能提供未知物的化學組成信息，結合化學及其它線索幫助識別化合物。 表3顯示了結果總結。值得注意的是，對于每個測試的化合物，得到的有用分子式信息用于譜庫檢索結果的確證。壞的情況，苯乙烯(C8H8, MW=104.0626 Da )的分子離子(名義質量為m/z 104 Da)用于化合物識別，譜圖準確度排名第五，進一步研究表明，二甲苯與苯乙烯是共流出物，它也在m/z 104 Da產生M-H2的干擾碎片離子，苯乙烯分子離子的譜圖準確度為89.3%，遠低于觀察的大部分離子的98%典型值及更好的99%。低譜圖準確度對于不正確化合物識別是很好的指示，而質量準確度做不到這點。干擾現象很容易通過對比測量譜圖和理論譜圖進行證實(如圖3)，明顯看到不好的匹配結果，可以猜測是干擾造成的。當仔細研究和檢查色譜峰后，猜測二甲苯是一個共流出物，為了證實這點，將二甲苯的分子離子和它的M-H離子包含進來重新進行CLIPS搜索，搜索自動計算這三個離子的好匹配，得到99.75%更好譜圖準確度，因此可以確認差的譜圖準確度是干擾造成的。 表3. 全部化合物的測試結果總結。根據譜圖準確度排名，90個化合物中除了4個外正確離子都排在前兩位 該方法的優點是完全以現存的分析方法基礎，使用替代化合物和內標，不需要額外的譜圖校正標樣如PFTBA，因此對現存的分析方法不需改變。這簡化了分析過程且改進了譜圖校正，僅需要額外的數據分析步驟就得到分子式結果，這意味該方法很容易適合其它實驗室。 將CLIPS搜索應用到多個離子碎片，很容易在GC/MS上進一步提高分子式識別的確證程度(見表4)，因為碎片離子的組成元素一定來源于其分子離子。這里，對我們有利的事實是EI離子化提供了豐富的化學信息，利用這個相同的方法，我們可以解決NIST譜庫檢索中分子離子峰很弱或沒有的情況。在完全未知物時，碎片丟失也能給出結構線索。通過識別不相關分子和碎片離子，這些信息也能用于幫助識別化合物是共流出物。 圖3. 頂圖顯示m/z 104苯乙烯離子(C8H8, 紅色)與其理論譜圖(黑色)疊加圖，匹配結果很差，暗示有干擾離子存在。底圖為包含了二甲苯(C8H10)和脫氫的二甲苯的匹配圖，混合物匹配的譜圖準確度為99.75%，確認存在二甲苯干擾。 表4. 甲基丙烯酸乙酯兩個碎片離子的CLIPS檢索結果。正確的分子離子排在第二位，通過分析另一個m/z 69離子，正確的分子式能夠根據m/z 69 碎片(C4H5O)丟失C2H5O推斷出來 結論 表3說明的90個測試化合物中，81個化合物確證的分子式在CLIPS檢索列表中排在位，5個化合物排在列表的第二位，總共超過95%化合物具有很高的確證效率，其余的四個化合物排在3-5的位置，該結果清楚表明，通過這個方法得到的譜圖準確度和質量精度對于GC/MS譜庫檢索提供了高度可靠的確證。這個方法關鍵優勢在于，能夠運行在成本較低的流動GC/MS儀器，通常可用于個人負責的初始響應形式，這個額外確認能力在緊急時刻甚至生命危機時刻是非常關鍵的。 同樣方法也很容易擴展到其它應用領域，GC/MS系統對未知半揮發有機化合物(SVOCs)進行快速識別，包括香精香料、藥物降解、天然產物識別和污染等等。這種方式結合化學離子化GC/MS對于未知化合物結構解析提供額外的有價值信息。 參考文獻 [1] Gu, Ming, et al “Accurate mass filtering of ion chromatograms for metabolite identification using a unit mass resolution liquid chromatography/mass spectrometry system”, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006; 20: 764–770. [2] EPA METHOD 8260B VOLATILE ORGANIC COMPOUNDS BY GAS CHROMATOGRAPHY/MASS SPECTROMETRY (GC/MS) (see www.epa.gov) [3] Manufacturers published specification for the Waters GCT Premier. Waters Corporation, Milford, MA. [4] Kind, T. et al “Metabolomic database annotations via query of elemental compositions: Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm”, BMC Bioinformatics 2006, 7, 234 (www.biomedcentral.com/1471-2105/7/234). [5] S.E. Stein and D.R. Scott, “Optimization and testing of mass spectral search algorithms for compound identification”, J. Am. Soc. Mass Spectrom 5 (1994), pp. 859–866.
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