AccuTOF DART系統的峰形校正和分子式測定
引言 運行在5000或更高分辨率的飛行時間質譜(TOF)，通過細致實驗，及將一個或更多內標與分析物選擇性或同時引入質譜系統的鎖定質量噴霧[2]或雙噴霧[3]，能夠獲得5 ppm甚至更高的質量精度。DART離子化技術的發明，大大簡化了這些內標的引入，由于可以適用不同類型的樣品，它可以很少或不需要樣品制備過程，實時或現場進行質量測定[4]。 雖然5 ppm的高質量精度對于元素組成檢測是必要的，但這對于未知物分子式識別并不充分，即使是高于ppm級的質量精度，也有一些化學上可能的分子式待選，特別是當m/z高于400 Da[5-6]。 幸運的是，有其它重要信息能用于分子式測定。優于單同位素峰的單點質量測定，對于一個給定離子，整個同位素輪廓，無論是完全分開與否，包含潛在同位素分布的精細結構信息，而這同元素組成密切相關。簡單測定同位素峰(M、M+1、…)的相對強度，對于減少可能分子式列表是非常有用的附加工具，特別是化合物含有Br-、Cl-或S-有顯著同位素特征元素時[5]。其它方式包括簡單的計算機建模，以及精心構建高斯或其它峰形函數[7-9]，但是，這些方式僅僅試圖大致接近真正的同位素輪廓圖，因為實際測量得到的峰形是未知或不能使用，導致產生百分之幾的建模誤差，這個級別的誤差大于分子式譜圖之間的細微差別，大大限制了同位素輪廓信息的使用。TOF MS系統的離子到達時間分布(峰形)具有特征的較大拖尾，建立足夠準確的峰形函數用于分子式區分變得更為困難(如果可能)。 這篇應用文章通過來自AccuTOF DART系統的一個實例，顯示了TOF MS峰形校正對于分子式識別的重要性，說明不使用內標或外標，利用MassWorks sCLIPS(自校正線形譜圖同位素輪廓搜索)對于分子式檢測的可行性。 實驗 名義質量數m/z為319 Da的未知化合物及作為內標的PEG離子，在AccuTOF DART系統測量，然后將平均化的質譜輸出為JCAMP數據格式輸入到MassWorks軟件(Version 2.0，2008年4月22日發布，Cerno Bioscience, Danbury, CT, USA)處理并進行分子式測定，離子計數閾值設置為零，以便確保采集得到真正的原始輪廓模式MS數據。 結果 圖1(頂圖)顯示了輸入到MassWorks后的完全質譜圖，圖1(底圖)顯示名義質量為319 Da的感興趣未知離子部分。雖然有PEG離子能用作校正標準，但為了證明MassWorks 2.0新自校正特點(sCLIPS)的有用性，在這個應用中決定忽略這個校正離子。 圖2顯示了MassWorks sCLIPS的通常數據處理流程。對比低分辨系統如單級四極桿的CLIPS，sCLIPS的關鍵區別是使用未知離子本身的單同位素峰進行峰形校正，而不校正m/z質量軸，這種方式的基本原理基于以下三點： 1. 未知離子的單同位素(校正)峰，在m/z上盡可能地靠近其余的同位素峰 2. 未知離子的單同位素(校正)峰，在測量時間上盡可能靠近其余的同位素峰 3. sCLIPS使用的場合，如較高分辨的MS系統，其單同位素峰與其它同位素如M+1等實現了很好的分離，m/z通常是相當準確的，不需要額外的m/z校正。
圖1. 一個平均的AccuTOF DART MS譜圖(頂圖 -- 完全的MS譜圖;底圖 -- 319 Da未知離子的譜圖部分)
圖2. 高分辨MS系統用于分子式測定的MassWorks sCLIPS通常數據處理流程 一旦得到僅包含峰形的校正函數--有效地將實際峰形函數轉換為理想(已知的、對稱的和可用數學表達的)峰形函數，這個校正函數然后被用于到整個同位素輪廓圖，包括其余的同位素峰，得到一個校正的同位素輪廓圖。雖受隨機噪音和其它測量條件(如檢測器飽和)或數學誤差影響，但這個校正后的同位素輪廓圖本質上應該與正確分子式的理論計算譜圖是一樣的，換句話說，作為下面定義的譜圖準確度應該接近100.00%。
這里，e是符合殘余向量，r是校正的同位素輪廓向量，||.||2 代表向量的函數(或者平方和的方根)。譜圖準確度指標用于評價在一定質量誤差范圍內，測定的實際單同位素峰質量與實際單同位素峰質量相近的所有可能分子式的元素組成與給定化學式的符合程度。具有高譜圖準確度的分子式是感興趣未知離子的可能正確分子式。
圖3顯示了僅僅單同位素峰(頂圖)和全部同位素輪廓(底圖)經過sCLIPS校正前后的峰形對比，校正后的理想峰形明顯地補償了TOF的峰形拖尾，而沒有任何明顯的分辨率損失。應該注意的是，在318 Da存在一個可能來自M-H離子的質譜干擾，當sCLIPS分子式測定時也應該考慮。
圖3. 感興趣離子的原始(黑色)和峰形校正后(紅色)質譜圖(頂圖 -- 單同位素峰;底圖 -- 包含可能M-H離子的完全同位素輪廓) 表1顯示了sCLIPS分子式測定參數和結果，需要注意的是，可能存在的M-H構形用于混合搜索，MassWorks 2.0的一個新特點能處理三個相關的干擾離子，相應地，譜圖準確度工具現在能夠計算相對于319.1043 Da測定質量，從-1.5 Da到4.5 Da的質量范圍，因此覆蓋了可能干擾離子的全部同位素輪廓。總共70種不同分子式滿足±10 mDa的質量偏差(見表1)，正確的分子式C17H20N2SCl ，顯示了97.27%的高譜圖準確度. 作為MassWorks 2.0的新增特點，用戶可以點擊列表中的每個分子式，將分子式計算得到的理論質譜圖與校正后的譜圖進行疊加，觀察匹配程度。圖4顯示了校正后質譜圖與排名靠前(正確)的理論分子式C17H20N2SCl的譜圖疊加，說明包含來自M-H離子貢獻的全部同位素輪廓的很好譜圖匹配。事實上，軟件額外說明了M和M-H的相對濃度為91%和9%。對比圖3中顯示的原始譜圖與校正譜圖的不同，峰形校正清楚地表明了在得到高譜圖準確度上起到了關鍵的作用，這有助于實現的分子式測定，更有意義的是這是不需要內標或外標校正的前提下實現的。 表1. sCLIPS分子式檢測參數和結果(僅顯示了70個待選分子式的前16個)
圖4. 譜圖準確度為97.27%排在位的分子式(C17H20N2SCl)的理論質譜圖(綠色)與校正譜圖(紅色)的疊加
圖5顯示了校正后譜圖與排名第二分子式(C15H24O3SCl )的譜圖匹配，該分子式僅有15個碳，譜圖準確度為96.52%，顯示在320 Da峰上的輕微不同，再一次表說明了用已知峰形函數對真正同位素輪廓建模的重要性。有趣的是，在表1的可能分子式列表中，排在頂部的待選分子具有氮元素，說明這種疊加質譜圖能作為分子式可能元素檢測的有效工具用。
圖5. 譜圖準確度為96.52%排名第二的分子式(C15H24O3SCl，無氮元素)的理論譜圖(綠色)與校正譜圖(紅色)疊加圖
相似地，圖6顯示了沒有考慮M-H離子干擾時地譜圖疊加，質譜窗口為更小的-0.5- 4.5 Da，可以觀察到明顯的譜圖準確度降低(96.36%，相對于表1或圖4中包含M-H時的97.27%)，這個譜圖匹配的降低也能在320 Da離子匹配圖中清楚地看到。
圖6. 沒有考慮M-H離子的譜圖準確度為96.36%排名的分子式(C17H20N2SCl)的理論譜圖(綠色)與校正后譜圖(紅色)的疊加
結論
MassWorks sCLIPS不需要內標或外標校正標樣，通過利用未知物本身的同位素離子進行關鍵的峰形校正。峰形校正結合在AccuTOF DART系統上已經得到的高質量準確度，實現了分子式的識別，大大增加了儀器使用的方便性。增加的混合物搜索和交互式譜圖疊加功能，允許用戶查看校正和理論計算譜圖的匹配程度，對于任何存在的質譜干擾提供有價值的信息，也可以在分子式測定過程中包含和排出某些元素。
致謝
感謝JEOL USA, Inc的Robert B. Cody博士為本文提供的數據及其熱情討論。
參考文獻
[1] Jeol Ltd. Tokyo, Japan
[2] http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=1000396
[3] Edgar Naegele, Pharma Asia, April 25, 2008, http://www.pharmaasia.com/article-5582-statisticevaluationofmassaccuracymeasurementsbyesitofwithasampleofdegradationproductsfromtheantibiot-Asia.html.
[4] Robert B. Cody et al, Anal. Chem. 2005, 77, 2297-2302.
[5] Kind, T. BMC Bioinformatics 2006, 7, 234.
[6] Don Kuehl, Am. Lab. Online, January 2008, http://americanlaboratory.texterity.com/al-online/200801ol/?pg=18
[7] Evans, J. E.; Jurinski, N. B. Anal. Chem. 1975, 47, 961-963b
[8] Tenhosaari, A. Org. Mass Spectrom. 1988, 23, 236-239.
[9] Do Lago, C. L.; Kascheres, C. Comput. Chem. 1991, 15, 149-155.
[10] Yongdong Wang, US Patent 6,983,213, filed October 20, 2003.
[11] Yongdong Wang, Cerno Application Note Number 103, December 2006, http://www.cernobioscience.com/resources/ApplicationNotes/Agilent_LC-MS_Single_Quad_Infusion.pdf
關于綠綿科技
北京綠綿科技有限公司(簡稱：綠綿科技)以體現客戶服務價值為宗旨，以專業精神和技能為廣大實驗室分析工作者提供樣品前處理、樣品制備及分析、實驗數據精確分析和管理的全面解決方案，致力于協助客戶提高分析檢測的效率和水平。主要代理產品聯系電話：010-82676061/2/3/4/5/6/7/8
E-mail：info@lumtech.com.cn。
